顯微鏡相機(jī)：你可以只用一個(gè)嗎？

過(guò)去十年中顯微鏡攝像機(jī)的進(jìn)步現(xiàn)在可能意味著，對(duì)于絕大多數(shù)生物科學(xué)應(yīng)用而言，實(shí)驗(yàn)室可以放棄僅投資一臺(tái)高性能攝像機(jī)，該領(lǐng)域的**專家之一Simon Watkins，杰出教授和副教授匹茲堡大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教授，免疫學(xué)教授，創(chuàng)始人兼生物成像中心主任。

“目前幾乎所有生物科學(xué)用途的**佳解決方案是單色科學(xué)CMOS [互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體]相機(jī)，”沃特金斯補(bǔ)充道。這與幾年前相比發(fā)生了巨大的變化，當(dāng)時(shí)CCD [電荷耦合器件]相機(jī)是顯微鏡相機(jī)的主要支柱。

CMOS（或sCMOS）和CCD都是數(shù)碼相機(jī)中的成像傳感器 - 相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)35mm膠片相機(jī)中的一塊膠片。按下快門時(shí)，光線進(jìn)入相機(jī)，顯微鏡上的圖像（或任何其他圖像）會(huì)曝光到傳感器上。CCD按順序轉(zhuǎn)換構(gòu)成圖像的像素的測(cè)量值，而CMOS同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)換。“這意味著CCD的讀數(shù)通過(guò)單個(gè)節(jié)點(diǎn)推動(dòng)，因此當(dāng)您向傳感器添加更多像素時(shí)，您的**大幀速率會(huì)下降，”生物系統(tǒng)產(chǎn)品經(jīng)理Nathan Claxton說(shuō)道，尼康儀器公司的成像部門。“另一方面，使用科學(xué)CMOS，你不一定要犧牲像素的速度。”

當(dāng)大約十年前科學(xué)CMOS**出現(xiàn)時(shí)，由于CMOS的靈敏度限制，CCD相機(jī)仍然主導(dǎo)著顯微鏡市場(chǎng)。早期的CMOS相機(jī)具有正面照明，這意味著它們的量子效率（QE） - 每個(gè)像素檢測(cè)到的入射光子的比例 - 必然是有限的。背光照明技術(shù) - 后透薄技術(shù) - 早已可用于CCD相機(jī)，在超低光應(yīng)用中具有優(yōu)勢(shì)。

前照式CMOS設(shè)備仍然是非常有用的相機(jī)，當(dāng)然比傳統(tǒng)的CCD相機(jī)更好。然而，在過(guò)去兩年中，出現(xiàn)了**新一代背照式科學(xué)CMOS相機(jī)，QE大于95％，并且所有相同的低讀取噪聲和高幀率**初吸引前照式CMOS用戶相機(jī) - 基本上取代了CCD相機(jī)。“不到五年前，CCD仍然是我們**受歡迎的顯微鏡相機(jī)。但現(xiàn)在，科學(xué)的CMOS已經(jīng)取代了它，“克拉克斯頓說(shuō)。

顯微鏡成像的標(biāo)準(zhǔn)三角形是分辨率，速度和靈敏度。

“顯微鏡成像的標(biāo)準(zhǔn)三角形一直是分辨率，速度和靈敏度。過(guò)去，如果你想在三角形上找到更多的東西，你總是不得不放棄其中一方，“卡爾蔡司顯微鏡北美產(chǎn)品營(yíng)銷組經(jīng)理Scott Olenych說(shuō)。“如果你想要更快的速度，你必須放棄靈敏度或分辨率。但你可以說(shuō)sCMOS擴(kuò)大了這個(gè)三角形 - 而不是選擇一個(gè)或兩個(gè)邊，你可以讓它們更好。“

因此，沃特金斯博士建議，今天用戶可以選擇單個(gè)相機(jī)來(lái)滿足他們所有的顯微鏡成像需求 - 也許，除了一些利基用途，如旋轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡和單分子成像。

但是顏色怎么樣？如果您只進(jìn)行明場(chǎng)成像，光線充足，那么彩色相機(jī)的QE通常較低也不成問(wèn)題。但是當(dāng)在低光下使用熒光樣品時(shí) - 例如全內(nèi)反射熒光（TIRF）顯微鏡 - 彩色相機(jī)不是您的**佳選擇。因此，如果您使用的是兩用顯微鏡，那么您不需要兩個(gè)不同的相機(jī)嗎？

有一種更簡(jiǎn)單（也更便宜）的解決方案：使用單色sCMOS相機(jī)并將其與高速三色透照光源（二極管）配合使用，可以在紅色，綠色和藍(lán)色波長(zhǎng)之間切換。“它收集來(lái)自三個(gè)顏色通道的圖像，我所知道的每一塊商業(yè)軟件都可以自動(dòng)將它們組合在一起并平衡顏色，為您提供彩色圖像，”沃特金斯說(shuō)。

**款帶有背薄傳感器的sCMOS相機(jī)進(jìn)入市場(chǎng)的是pHotometrics的Prime 95B，這是一款144萬(wàn)像素的攝像頭，可提供95％的QE（相比前照式sCMOS攝像頭的60-80％QE）。2017年11月，該公司發(fā)布了400萬(wàn)像素的Prime BSI。“Prime相機(jī)提供了近乎**的靈敏度，并允許研究人員專注于相機(jī)的其他性能方面。這兩款相機(jī)的主要區(qū)別在于Prime 95B的像素比素有更大的像素，而BSI的像素更小，但更多像素，“pHotometrics的科學(xué)產(chǎn)品經(jīng)理Rachit Mohindra解釋道。“使用較小的像素，Prime BSI成為空間分辨率的更好選擇，可以看到更精細(xì)的功能。95B具有更大的像素，對(duì)于更高的放大倍率和進(jìn)一步**大化的靈敏度變得更好。“

圖像：使用Prime 95B Scientific CMOS相機(jī)拍攝的STORM超分辨率圖像。細(xì)胞類型：U2OS細(xì)胞。曝光時(shí)間：30毫秒。放大倍數(shù)：150倍（配置像素大小~73納米）。使用的重建算法：?jiǎn)蜳SF擬合的**大似然估計(jì)（MLE）方法。圖片由紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院的YanDOng Yin和Eli Rothenberg提供。

目前，pHotometrics憑借目前**可用的背面薄型sCMOS相機(jī)在該領(lǐng)域占據(jù)主導(dǎo)地位，但隨著其他制造商進(jìn)入這個(gè)競(jìng)爭(zhēng)激烈的領(lǐng)域，這種情況很快就會(huì)發(fā)生變化。

但是暫時(shí)不計(jì)算CCD。“CCD相機(jī)仍然是顯微鏡成像的重要組成部分，用于成千上萬(wàn)的顯微鏡，而且每年都會(huì)購(gòu)買很多顯微鏡，”Olenych指出。“由于相對(duì)較低的成本和多功能性，它們是許多人選擇用于顯微鏡成像需求的相機(jī)選項(xiàng)。”

此外，對(duì)于旋轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡或單分子研究中的低光成像，一些用戶可能仍然更喜歡電子倍增CCD相機(jī)，它使用片上倍增增益來(lái)實(shí)現(xiàn)單光子檢測(cè)靈敏度，而不會(huì)影響QE或分辨率。“這是一款研究級(jí)相機(jī)，永遠(yuǎn)用于這兩種應(yīng)用。但老實(shí)說(shuō)，即使在這些情況下，我也會(huì)爭(zhēng)辯說(shuō)，任何考慮購(gòu)買新相機(jī)的人都應(yīng)該考慮新的背面薄型sCMOS相機(jī)，“沃特金斯博士建議道。“你真正想要一個(gè)EMCCD相機(jī)的**時(shí)間是你**需要放大電路，這可能會(huì)產(chǎn)生噪音問(wèn)題。”

在某些情況下，例如在共聚焦顯微鏡上使用基于陣列的探測(cè)器，或者在處理非?？斓牡凸鈺r(shí)，用戶仍可能發(fā)現(xiàn)EMCCD更好。**可以確定的方法是：將兩臺(tái)攝像機(jī)放入您將使用它們的環(huán)境中，然后測(cè)試它們。“這是購(gòu)買顯微鏡相機(jī)的主要信息：測(cè)試一切，買一次，”沃特金斯博士警告說(shuō)。“我看到大量買家對(duì)這些相機(jī)的懊悔。請(qǐng)您的供應(yīng)商讓您在現(xiàn)實(shí)世界的實(shí)驗(yàn)室條件下測(cè)試您正在考慮的相機(jī)。“

在經(jīng)過(guò)深思熟慮的科學(xué)CMOS的大躍進(jìn)之后，顯微鏡相機(jī)技術(shù)的下一步是什么？“到目前為止，制造商之間的競(jìng)爭(zhēng)一直是提高相機(jī)的速度，同時(shí)增加量化寬松，”克拉克斯頓說(shuō)。“現(xiàn)在許多sCMOS相機(jī)的QE為95％，你不能再遠(yuǎn)離那里了。隨著更多背照式sCMOS相機(jī)的推出，它們將達(dá)到這個(gè)極限。在短期內(nèi)，我們可能會(huì)看到將高QE與低噪聲相結(jié)合，同時(shí)使像素更小 - 一個(gè)大視場(chǎng)，但不要犧牲分辨率來(lái)做到這一點(diǎn)。短期內(nèi)的夢(mèng)想是以非常高的分辨率看待事物，但是在很大的范圍內(nèi)。“