你準備好創作一件藝術品嗎？

固定細胞成像技巧

你準備好從你的免疫熒光實驗中創建令人大開眼界和可發表的圖像嗎？了解免疫熒光方案的基本步驟將幫助您生成**能傳達數據的圖像，這些提示可以使圖像成為一件藝術品。

不幸的是，沒有一種**的染色固定細胞方案，因此需要優化新抗體的方案。從長遠來看，找到有關哪些條件與抗體 - 抗原組合良好協作的信息可能會有很大幫助。一點點的前期文獻搜索是值得的，它節省了令人驚嘆的圖像。

染色細胞用于成像有六個基本步驟：樣品制備，固定，透化，阻斷，抗體孵育和安裝。以下是一些有助于優化每個步驟結果的提示。

1.樣品制備

必須具備正確培養基，血清，溫度和CO2濃度的孵育條件。另外請記住您正在生長它們的基材以及它對您的成像平臺的作用。通常，這意味著在培養皿或培養皿中涂覆的蓋玻片上培養細胞，但它也可能意味著在多孔板，懸浮液瓶中或3D細胞培養物中生長。直立式顯微鏡通常需要蓋玻片上的細胞，而倒置系統也可以在多孔板或培養皿中成像細胞。

在開始免疫熒光方案之前，請始終檢查細胞的一般健康狀況和融合情況。你有足夠的細胞嗎？它們是否具有預期的形態，或者它們是否起泡，變圓或從基材上脫落？

提示＃1 - 在開始優化成像之前，要知道您的細胞表達抗體的抗原。  這似乎很簡單，但你會驚訝于許多研究人員在跳轉到抗體 - 抗原組合的免疫熒光染色之前忘記做一個簡單的蛋白質印跡。

提示＃2 - 優化緩沖區。經常被忽視的優化領域之一是緩沖區選擇。在固定和透化后的孵育和洗滌期間使用緩沖液; 使用正確的緩沖區可以對信號強度產生很大影響。大多數科學家自動轉向PBS以滿足其染色需求，但pHEM或CSK等緩沖液（通常在較低pH值下使用）可能對細胞骨架或細胞質抗原有幫助。

2.固定。

通過所有這些孵化和洗滌盡可能保持細胞完整是既棘手又極其重要的。固定是維持細胞結構的關鍵步驟。許多商業銷售的一抗已經用特定的固定劑驗證，但是新抗體需要建立優化的方案。

有兩類固定劑可供選擇：醛固定劑和有機溶劑。醛固定在細胞骨架和膜內使蛋白質彼此交聯，因此是在這些結構中標記抗原的選擇方法。然而，這種方法化學修飾蛋白質并且可以掩蓋它們，使得檢測更加困難。一個很好的起點是基于甲醛的Image-iT®固定/滲透穩定試劑盒，適用于大多數細胞類型。有機溶劑，如甲醇，乙醇和丙酮，不會通過交聯改變蛋白質，但它們會使蛋白質變性和沉淀。這種方法可能對那些具有“埋藏”抗原的抗體有益，例如在細胞核中。

提示＃3-不要使用有機溶劑來固定含有熒光蛋白標簽的細胞。   這可能使您標記的融合蛋白變性，使您無信號。

提示＃4 - 反作用固定劑誘導的自發熒光。  一些樣品易于發生固定誘導的自發熒光，這可以通過用10mM的BH 4或NH 3 Cl 還原醛基來減輕。戊二醛對自發熒光特別不利。

提示＃5 - 可能需要抗原檢索方法。  如果抗原被掩蔽，例如通過醛交聯，則通常可以通過用熱，壓力和/或特殊緩沖液（例如檸檬酸鹽緩沖液）處理來掩蓋抗原。已經公布了對這些方法的大量評論，并且有時商業抗體來源將推薦一種方法。

3.滲透性

透化有助于通過脫脂膜使抗體通過細胞膜和固定細胞內部。有許多不同的洗滌劑可用于透化細胞，包括NP-40，Triton X-100，Tween-20和皂苷。

所需的透化程度取決于抗原的位置和所需的外顯深度。例如，如果您感興趣的蛋白質位于細胞表面或細胞外基質中，那么您可能不需要太多透化，如果有的話。事實上，你可以通過這個程序去除膜，從而失去膜結合蛋白。然而，細胞間靶標需要一些透化方法以使抗體到達抗原。需要優化時間和濃度，但一個很好的起點是基于TritonX-100的Image-iT®固定/滲透穩定試劑盒。

提示＃6-優化固定和透化方法。通過在不同的時間和濃度嘗試不同的化合物來做到這一點。您正在尋找良好的細胞或組織形態和強烈的特定染色。文獻檢索有時也可以證明是有用的。

4.阻止

由于非特異性蛋白質結合，通過阻斷抗體與樣品的非特異性結合，可以改善任何免疫熒光染色。牛血清白蛋白和熱滅活的正常血清可用作非特異性阻斷劑，并且還有一些可用于此目的的商業產品，例如BlockAid TM阻斷溶液。在抗體孵育之前以及在一抗孵育溶液中施加封閉溶液。

提示＃7-仔細選擇阻斷劑。  不要使用與產生一抗的物種相同的血清。什么都不會擺脫那個背景！

提示＃8-可能需要額外的阻塞解決方案。  使用Image-iT FX信號增強器可以阻止由染料電荷引起的非特異性結合。專門的方法，如酶促或生物素 - 抗生物素蛋白擴增，也需要阻斷一些細胞和組織中常見的內源性過氧化物酶，磷酸酶或生物素。

5.抗體孵育

實際的檢測步驟包括用**抗體和染料綴合的第二抗體沐浴細胞或組織。同樣，必須仔細優化**終濃度和孵育時間，但是對于培養細胞的顯微鏡檢查，通常在室溫下在0.5-10μg/ mL的范圍內持續30-60分鐘。多個一抗也可以在一個步驟中組合。 

通常用針對一抗的宿主物種的染料綴合的二抗檢測一抗。當組合多種一抗時，確保不同的二級抗體與其他物種交叉吸附，否則它們會交叉標記，導致信號混亂。確保使用的染料與顯微鏡可用的過濾器選項和/或激光線匹配，并且是具有明亮和光穩定性的染料，例如Alexa Fluor染料。

提示＃9-為您的目標使用**好的一抗。這是該過程中**重要的部分之一。如果做得好，您將獲得明亮，特定的污漬準備出版。**的抗體將具有良好的親和力和特異性。值得研究和支付**好的抗體。如果生成自己的，請花時間設計抗體。從長遠來看，它會得到回報。確保它不老和退化！

提示＃10-使用適當的控件。您將需要非初級（僅次級）對照來測試二抗的特異性。沒有抗體或染料的對照也將測試自發熒光。如果使用多種一抗，則進行單抗體對照以測試交叉標記。

5.安裝

如果您的染料之后不穩定，那么通過所有這些步驟和優化的重點是什么？一旦**終洗滌完成，標記的樣品將需要處于**佳保留染料信號的成像環境中。雖然細胞可以在緩沖液或緩沖液/甘油溶液中成像，但**好的選擇是將細胞置于防褪色安裝介質中，這將保留初始信號并減少光漂白（由于曝光而變暗）并且具有足夠高的折射率實現**的分辨率。

提示＃11-選擇**適合您成像時間線的防褪色劑。  如果您立即成像然后丟棄幻燈片，您的封固劑可以保持液態，例如SlowFade（R）Diamond。但是，如果您希望將幻燈片存檔**或更長時間并在以后拍攝圖像，則需要使用硬化或“固化”的固定劑，例如ProLong（R）Diamond。