實驗室規模蛋白質純化

實驗室規模的蛋白質純化彌補了小規模探索性蛋白質純化與高通量操作（如工業規模制造）之間的差距。在規模較大的一端，上游加工的進步，例如改進的發酵能力，導致可用于投入的原油樣品量增加。盡管這意味著目標蛋白質的潛在產量更高，但它也對下游的及時和成本有效的樣品處理提出了巨大的挑戰。由于雜質含量較高導致規模增加，這一挑戰變得更加困難 - 這是由于大規模細胞培養中發酵時間延長和細胞密度增加所致。

通常，在**初的探索性蛋白質純化階段進行了許多優化工作。在這里，您將確定您的目標蛋白質是否存在任何溶解度問題，從而緩解其中**快樂的問題，以及其純化的基本策略。然而，在實驗室規模階段進行的工作對于在探索性和大規模蛋白質純化之間成功轉變**關重要。它使您能夠研究如何增加工作量，而不會影響產品回收率或純度。

通常，許多蛋白質純化方案依賴于色譜的應用，無論處理的體積如何。實驗室規模程序也不例外，這里的色譜過程可以分為三個主要階段：目標蛋白質捕獲，中間純化和**終拋光[1]。這些階段中的每一個階段在處理工作流程中執行特定功能，因此在涉及流程設計時具有其自己獨特的一組要點。同樣，每個階段在擴大規模期間都會遇到不同的挑戰。本文討論了開發實驗室規模蛋白質純化的下游工作流程時要考慮的重要因素，重點是色譜。

蛋白質捕獲

蛋白質捕獲的基本目標是盡可能快地收集和保留盡可能多的目標蛋白質，同時讓不需要的雜質不受阻礙地流過分離介質。在此階段，您選擇的色譜樹脂的分辨性質不如其對目標蛋白質的結合能力那么重要。

親和色譜樹脂通常用于蛋白質純化的這個階段。它們是靶蛋白富集的有效方法，可快速將它們與任何可能損害它們的雜質隔離。它們基于蛋白質對基質結合配體的吸引力而工作，并且這種相互作用可以由天然蛋白質部分介導或通過工程添加親和標簽。如果您的過程涉及外源標簽，請仔細考慮如何在凈化過程結束時將其去除。首先詢問您是否需要刪除標簽; 通過蛋白酶處理去除標簽可以為您的方案添加**少另**。如果這是**必須的，請記住在下游工作流程中構建純化步驟，完全刪除標簽，

如果您需要避免使用基于親和力的純化，因為您希望避免在目標蛋白質中引入標簽，離子交換層析樹脂可能是蛋白質分離的另一種選擇。這些將在下面更詳細地討論。

無論您選擇哪種捕獲方法，請考慮此初始階段將處理**大的樣本輸入量; 因此，需要相對較快的流速來保持工作流程的效率。選擇具有良好流動特性的較大珠粒樹脂（例如，非常親水的珠粒材料）以改善整體加工時間而不損害粘合能力。當這個過程**終擴展時，這對你有利。

中間凈化

在中間純化階段，目標蛋白的分辨率是一個更重要的優先事項。即使在上一步中已經去除了大量雜質，一些宿主細胞污染物仍會潛伏在樣品中。在這個階段，使用具有**佳珠粒尺寸的色譜樹脂可能是誘人的，因為珠粒尺寸與**終產品分辨率相關; 然而，中等尺寸的珠子通常更適合于該過程的這個階段。速度不太重要，因為任何會影響靶蛋白穩定性或活性的雜質都會在捕獲步驟中被除去。但是，中等珠粒尺寸將在加工時間和純度之間提供**佳折衷，因為它們仍然允許去除異質元素，例如電荷變體或截短蛋白質。

離子交換色譜是中間階段純化的常用選擇。它根據電荷和相反電荷矩陣的吸引力捕獲蛋白質。可以通過使用增加的離子強度或pH梯度或等度洗脫來進行分離，其中流動相保持不變但是基于極性促進物質通過基質的更快或更慢的通過。這些蛋白質分離的差異方法看到目標蛋白質在不同的洗脫窗口期間進入流動相，從而允許微調洗脫并進一步濃縮目標蛋白質。

您還應考慮在此中間階段使用混合模式樹脂。混合模式樹脂由于其組成而具有獨特的分離性能，其由多種分離方式組成。增加純化過程中使用的分離方法的數量和種類會產生更高質量的**終產品。使用混合模式樹脂簡化了這種策略，為各種生物分子提供了**的選擇性和分辨率。它還能夠在較高鹽濃度下加載樣品，具體取決于目標蛋白質和所用的混合模式樹脂。這消除了對離子交換色譜通常需要的緩沖液交換或透析步驟的需要，減少了總處理時間和樣品損失的可能性。

**終拋光

在色譜的**終拋光階段，主要目標是通過去除痕量污染物來實現目標蛋白的高分離度，并將其與任何不需要的結構變體分離。對于**終的拋光色譜，也建議使用小珠粒尺寸。請注意，使用較小的珠粒尺寸會導致壓力增加; 在這種情況下，應使用較低的流速，這意味著處理時間可以更長。

尺寸排阻色譜（SEC）通常用于此目的，因為它可以去除任何揮之不去的雜質，但也可以處理化學上相似但結構上不合適的蛋白質種類，例如目標蛋白質的二聚體或降解形式。顧名思義，它是一種非結合技術，根據蛋白質的大小差異分離蛋白質。使用等度緩沖液作為標準，如果您想獲得**佳分辨率，重要的是要考慮SEC基質只能處理低樣品量負荷（平均≤矩陣體積的10％）。

**后一句話

實驗室規模的蛋白質純化為未來的加工成功奠定了基礎，因此設計一個工作流程不僅可以產生**純凈的蛋白質產品，而且還可以保持未來的可擴展性。考慮在實驗室規模實驗中按照上述順序使用色譜樹脂。請記住，不同供應商的每種介質類別中都有各種樹脂，因此在設計過程中考慮每種樹脂的優缺點也是有益的。有些更適合實驗室規模流程的需求。