從條件組織培養基中產生和分離外泌體

術語外來體通常被理解為參考特定類別的脂質膜結合的細胞外囊泡（EV），其特征在于直徑為40nm**150nm，密度為1.09g / ml**1.18g / ml。外來體參與各種細胞活動，并且已被證明可從多種體液中分離，包括唾液，尿液，血漿，血清，母乳和羊水，以及培養細胞的條件培養基[1]。事實上，外泌體可以從任何可培養的細胞類型中分離。已經證明純化的外泌體在多種體外和體內模型中具有臨床相關的治療生物活性[2,3]。在診斷領域，從體液中分離的外泌體，尤其是血液，已證明其作為特定疾病的生物標志物的價值。在這篇文章中，

沒有FBS的文化

牛血清含有豐富的外泌體。為了優化對感興趣的外來體靶標的分析，**好從待收獲的培養基中去除血清。大多數培養的細胞可以在無血清培養基中耐受24或48小時的生長（測試細胞的耐受性相對簡單 - 在無血清培養基中孵育后檢查細胞活力）。用含有血清的培養基建立培養物后，用大量無血清培養基清洗附著的細胞**少三次，然后向培養物中加入**少量的無血清培養基，再返回培養箱24小時。 48小時。得到的條件培養基將含有大量來自您感興趣細胞的外泌體。你的細胞不能耐受24小時沒有血清，

苯酚無紅色介質

條件培養基的超速離心是分離外泌體的更常用的方法之一，特別是如果你有更大量的培養基（> 100毫升）。超速離心以沉淀外泌體后，盡管采用**嚴格的方法去除離心管中過量的培養基，但當將沉淀重懸于磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）或另一種透明緩沖液中時，通常會有一些培養基殘留物。對于某些下游應用，特別是直接光度分析，即使少量的酚紅也會影響您的讀數。只要您用無酚紅培養基洗滌和培養培養物進行調理和隨后的外泌體分離，就可以接受含有酚紅的培養基以促進細胞生長。

近似蛋白質和RNA量

你已經分離了你的外泌體，想要確定你有多少蛋白質和RNA。標準測量通常需要裂解步驟，并可能需要10 米升**100 米樣品的升。實例包括用于測量蛋白質的標準Bradford測定法或用于記錄外來體RNA水平的分光光度讀數。在許多情況下，您的外泌體可能供不應求，或者**小體積小于100 m l。由于這些方法只是數量的近似值，因此**好使用NanoDrop ND-1000分光光度計等儀器，可直接測量1 m l**1.5 ml樣本。然后，您將獲得更多珍貴的外泌體材料，可用于進行功能或生化分析。

相關性可能很棘手

雖然確實有更多的細胞會導致更多的外泌體分離，但特定的外泌體數量似乎并不具有一致的總蛋白質或RNA含量。盡管控制細胞數量和傳代，培養基體積和培養時間，但缺乏可預測性似乎在相同和不同細胞類型內和跨越相同和不同細胞類型。即使有來自**少20個原代細胞和細胞系的條件培養基的數百個外泌體分離的經驗，這些參數之間的可預測的相關性也是難以捉摸的。當比較同一實驗室內不同批次的外泌體以及將結果與其他實驗室的結果進行比較時，這可能會帶來挑戰。在比較不同研究人員和不同實驗室的不同制劑結果時，請記住這一點。

結論

盡管有許多方法可用，但仍然缺乏關于如何**佳分離，定量，大小和表型表征外泌體的統一共識。在查看其他實驗室的結果并將其與您的數據進行比較時請記住這一點。設計用于測量相同參數的不同技術（例如EV尺寸和濃度）通常產生稍微不同的結果。無論您使用何種方法和技術來獲得所需的結果，請遵循這些建議的提示并與您的方法保持一致。