從條件組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生和分離外泌體
術(shù)語外來體通常被理解為參考特定類別的脂質(zhì)膜結(jié)合的細(xì)胞外囊泡（EV），其特征在于直徑為40nm**150nm，密度為1.09g / ml**1.18g / ml。外來體參與各種細(xì)胞活動(dòng)，并且已被證明可從多種體液中分離，包括唾液，尿液，血漿，血清，母乳和羊水，以及培養(yǎng)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基[1]。事實(shí)上，外泌體可以從任何可培養(yǎng)的細(xì)胞類型中分離。已經(jīng)證明純化的外泌體在多種體外和體內(nèi)模型中具有臨床相關(guān)的治療生物活性[2,3]。在診斷領(lǐng)域，從體液中分離的外泌體，尤其是血液，已證明其作為特定疾病的生物標(biāo)志物的價(jià)值。在這篇文章中，
沒有FBS的文化
牛血清含有豐富的外泌體。為了優(yōu)化對感興趣的外來體靶標(biāo)的分析，**好從待收獲的培養(yǎng)基中去除血清。大多數(shù)培養(yǎng)的細(xì)胞可以在無血清培養(yǎng)基中耐受24或48小時(shí)的生長（測試細(xì)胞的耐受性相對簡單 - 在無血清培養(yǎng)基中孵育后檢查細(xì)胞活力）。用含有血清的培養(yǎng)基建立培養(yǎng)物后，用大量無血清培養(yǎng)基清洗附著的細(xì)胞**少三次，然后向培養(yǎng)物中加入**少量的無血清培養(yǎng)基，再返回培養(yǎng)箱24小時(shí)。 48小時(shí)。得到的條件培養(yǎng)基將含有大量來自您感興趣細(xì)胞的外泌體。你的細(xì)胞不能耐受24小時(shí)沒有血清，
苯酚無紅色介質(zhì)
條件培養(yǎng)基的超速離心是分離外泌體的更常用的方法之一，特別是如果你有更大量的培養(yǎng)基（> 100毫升）。超速離心以沉淀外泌體后，盡管采用**嚴(yán)格的方法去除離心管中過量的培養(yǎng)基，但當(dāng)將沉淀重懸于磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）或另一種透明緩沖液中時(shí)，通常會(huì)有一些培養(yǎng)基殘留物。對于某些下游應(yīng)用，特別是直接光度分析，即使少量的酚紅也會(huì)影響您的讀數(shù)。只要您用無酚紅培養(yǎng)基洗滌和培養(yǎng)培養(yǎng)物進(jìn)行調(diào)理和隨后的外泌體分離，就可以接受含有酚紅的培養(yǎng)基以促進(jìn)細(xì)胞生長。
近似蛋白質(zhì)和RNA量
你已經(jīng)分離了你的外泌體，想要確定你有多少蛋白質(zhì)和RNA。標(biāo)準(zhǔn)測量通常需要裂解步驟，并可能需要10 米升**100 米樣品的升。實(shí)例包括用于測量蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)Bradford測定法或用于記錄外來體RNA水平的分光光度讀數(shù)。在許多情況下，您的外泌體可能供不應(yīng)求，或者**小體積小于100 m l。由于這些方法只是數(shù)量的近似值，因此**好使用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)等儀器，可直接測量1 m l**1.5 ml樣本。然后，您將獲得更多珍貴的外泌體材料，可用于進(jìn)行功能或生化分析。
相關(guān)性可能很棘手
雖然確實(shí)有更多的細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致更多的外泌體分離，但特定的外泌體數(shù)量似乎并不具有一致的總蛋白質(zhì)或RNA含量。盡管控制細(xì)胞數(shù)量和傳代，培養(yǎng)基體積和培養(yǎng)時(shí)間，但缺乏可預(yù)測性似乎在相同和不同細(xì)胞類型內(nèi)和跨越相同和不同細(xì)胞類型。即使有來自**少20個(gè)原代細(xì)胞和細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基的數(shù)百個(gè)外泌體分離的經(jīng)驗(yàn)，這些參數(shù)之間的可預(yù)測的相關(guān)性也是難以捉摸的。當(dāng)比較同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不同批次的外泌體以及將結(jié)果與其他實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果進(jìn)行比較時(shí)，這可能會(huì)帶來挑戰(zhàn)。在比較不同研究人員和不同實(shí)驗(yàn)室的不同制劑結(jié)果時(shí)，請記住這一點(diǎn)。
結(jié)論
盡管有許多方法可用，但仍然缺乏關(guān)于如何**佳分離，定量，大小和表型表征外泌體的統(tǒng)一共識。在查看其他實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果并將其與您的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較時(shí)請記住這一點(diǎn)。設(shè)計(jì)用于測量相同參數(shù)的不同技術(shù)（例如EV尺寸和濃度）通常產(chǎn)生稍微不同的結(jié)果。無論您使用何種方法和技術(shù)來獲得所需的結(jié)果，請遵循這些建議的提示并與您的方法保持一致。
